[미생물학] PCR 결과레포트

# Material

- Template, Forward primer, Reverse primer, dNTP, Taq polymerase

10x Buffer, D.D.W

 

# PCR Method

① Denaturation

② Annealing

③ Extension

 

# Result & Discussion

▶ 우리 2조의 실험결과는 위의 사진과 같았다. PCR로 우리가 원하는 유전자를 증폭시킨 DNA는 약 600~700Kp 였다.

2-2를 보면 밑에 생긴 밴드를 Primer를 나타내는 밴드이다. 내가 실험할 때 피펫을 꾹 눌러버려 Primer가 좀 더 들어간 것 같아 양이 많이 넣어서 Primer 밴드가 생긴 것 같다.

 

▶ Primer를 제조해보면, Forward primer와 Reverse primer 이 두 primer로 나눌 수 있다.

Forward primer부터 먼저 살펴보면, pstⅠ이라는 제한효소를 사용해서 제조한다. pstⅠ의 서열은 CTGCAG이다. 조교님이 나눠주신 증폭할 DNA서열 앞부분이 ATGGTGAGCT TTTGCGAGCT이다.(앞의 1번부터 20번까지)

그러므로 Forward primer는 CTGCAG ATGGTGAGCT TTTGCGAGCT이다. 여기에서 보통 18~30 nt의 primer로 제조해야 되므로 위의 조건과 일치한다.

 

Reverse primer부터 먼저 살펴보면, xbaⅠ이라는 제한효소를 사용해서 제조한다. xbaⅠ의 서열은 TCTAAGA 이다. 조교님이 나눠주신 증폭할 DNA서열 뒷부분이 TCAAACGTTG TCGTTTTCA이다.(뒤의 끝부분부터 차례대로 상보적인 서열)

그러므로 Reverse primer는 TCTAAGA TCAAACGTTG TCGTTTTCA이다. 여기에서 보통 18~30 nt의 primer로 제조해야 되므로 위의 조건과 일치한다.

 

이제 Tm에 대해서 알아보아야 하는데, 우선 Tm이란 Double strand DNA가 single strand DNA로 되는 온도변화에 있어서 그 중간값을 Tm 이라고 하며 이 값은 DNA의 길이, 염기 조성에 따라 다르게 나타나며 이 값이 높을 수록 강하게 결합된다는 것을 의미한다. 염기수 N>14일 때는 Tm = 64.9 + 41 * (number of G's and C's in the primer - 16.4)/N 의 식으로 구한다. primer의 Tm이 너무 높거나 낮으면 잘못된 PCR 산물이 나오기 쉽고 보통 45도에서 60도 정도가 나오도록 그 값을 정하는데, 중요한 것은 PCR시 필요한 두개의 Primer(Forward primer와 Reverse primer)의 Tm이 서로 비슷해야 좋은 PCR산물을 얻을 수 있다.

 

Forward primer는 CTGCAG ATGGTGAGCT TTTGCGAGCT인데, Tm이 77.6℃ 이므로 염기수를 줄여야 한다. 그래서 18mer로 하면, CTGCAGATGGTGAGCTTT 이 되는데, Tm은 64.5 degrees C, GC content = 50.0%이다.

 

Reverse primer는 TCTAAGA TCAAACGTTG TCGTTTTCA 인데, Tm이 69.7℃ 이므로 염기수를 줄여야 한다. 대신에 GC content = 34.6%가 되므로 Primer 앞에 GC의 함량을 높이고 18mer로 해본다. CCCTCTAAGATCAAACGT 로 GC함량을 맞춰주기 위해서 제한효소서열 앞에 CCC를 붙였다. CCCTCTAAGATCAAACGT은 Tm은 62.2 degrees C, GC content = 44.4%이다. Tm과 GC함량이 차이가 많이 나지 않으므로 Primer로써의 기능이 될 것 같다.

 

 

Forward primer = CTGCAGATGGTGAGCTTT

Reverse primer = CCCTCTAAGATCAAACGT